一、實驗準備
1、健康的HEK 293T細胞,一般使用復蘇后10代以內的細胞進行慢病毒的生產,要求無細菌、真菌以及支原體污染;
2、轉染試劑,如PEI、Higene、lipo2000或lipo3000
各種轉染試劑的步驟稍有差別,小助手以PEI為轉染試劑。
3、DMEM無血清無雙抗培養基、DMEM培養基(10%FBS和1%P/S);
4、10mL無菌注射器(環氧乙烷滅菌處理);
5、0.45μm的細菌濾器。
二、包裝步驟
Day1
(7:00 PM)鋪板HEK 293T細胞
數量:400萬/10 cm dish ;覺得計數麻煩的話,可以在293T細胞長到約90%匯合時,1:5傳代(均分成5份),每1份的數目差不多就是400萬了。
Day2
(3:00 PM)三質粒轉染
在培養箱中恢復細胞狀態約20h,此時可進行轉染。三質粒的轉染體系三種質粒的配比有許多種方式,目前MDL使用4:3:1的比例,即PxpAx2:PMD2g:PLVX(載有你基因的質粒)。10cm dish一般轉染質粒的總質量為20μg,PEI的量為質粒的2.5-3倍(也就是50μg-60μg,一般推薦按照2.5倍來)。按照比例算下來,PxpAx2:PMD2g:PLVX的質量比為:(10ug:7.5ug:2.5ug)
注意:在提到質粒的量時,千萬記得說質量而不是濃度,不然容易出錯。
實驗步驟:
取如上總質量為20μg的質粒添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養基中,記為A液,移液槍混勻20次;
取PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg(也就是50-60μL)添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養基中,記為B液,移液槍混勻20次;
將B液逐滴滴加到A液中,移液槍輕柔混勻66次,室溫靜置15-20min;
將靜置好的轉染試劑(A+B)緩緩滴加到恢復狀態20h的HEK 293T細胞中。
做好標記,記好轉染時間、轉染質粒、換液時間等參數提高實驗重復性。
Day3
(9:00 AM)換液
轉染后的第18h,將含有轉染試劑的HEK 293T上清更換為10mL DMEM培養基;對于新手,為了防止在換液時將細胞吹散,可以留3mL的液體在dish中,更換8mL DMEM培養基。
Day4
(3:00 PM)收集病毒液
在轉染后的48-72h,為病毒生產的高峰期,一般我們收集轉染后48h(換液后30h,產毒30h)的病毒液用于實驗,足以滿足大部分實驗需求。收集病毒于15mL tube中,500g,5mL離心去細胞碎片和雜質,隨后使用注射器和濾器進行過濾。收集后的病毒上清可以用來進行感染和儲存。
三、慢病毒滴度測定
病毒滴度的單位為:TU/mL,代表每毫升病毒液中具有轉導功能的病毒顆粒的數目。
計算公式為:滴度=(感染時細胞數(個)*陽性細胞%)/病毒液體積(mL)
病毒液體積和感染時細胞數已知,需通過流式細胞術確認陽性細胞百分比。
滴度測定常常使用HEK 293T細胞,大致的原理為,將在DAY3收集到的病毒上清,按照梯度添加到293T細胞中,感染后48h檢測陽性細胞的比例,從而確定病毒的滴度。
四、注意事項
293T細胞的代數最好用15代以內,最多不超過20代,否則影響轉染效率。質粒濃度在400-1000ng/μL范圍,純度260/280在1.8-2.0之間的轉染效率較高?;旌象w輕輕滴入細胞上清后搖勻,動作要輕,293T細胞貼壁不牢避免細胞脫落。
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